反向色譜柱綜合了硅膠和聚苯乙烯色譜柱的優(yōu)點，同時避免了它們的缺點。以乙烯醇共聚物為基質(zhì)的色譜柱，即使含有高載炭量也能保持表面濕潤。多孔結(jié)構(gòu)具有足夠大的平均孔徑，可獲得理想的小分子化合物、多肽和小分子蛋白分離效果。在有機(jī)溶劑含量較高的流動相中，該柱的柱效與硅膠基質(zhì)色譜柱相當(dāng)，但在以堿性緩沖溶液為流動相時，分離效率超過硅膠柱。其顯著特點之一是基質(zhì)被烷基化填料的洗脫順序，其保留能力與烷基鏈長度成正比。

反相色譜柱的活化步驟：

1、使用20倍柱體積的甲醇或乙腈來洗滌色譜柱是必要的。

2、如果流動相中含有緩沖鹽，應(yīng)該使用與流動相中鹽的數(shù)量相等的超純水和有機(jī)相來沖洗過渡。沖洗時的用量應(yīng)為20倍色譜柱體積，然后使用含有緩沖鹽的流動相來平衡色譜柱，用量應(yīng)為20倍色譜柱體積或更多。

3、在流動相中不含緩沖鹽時，應(yīng)該使用容量為柱體積的20倍或更多的流動相平衡色譜柱。

4、在壓力基準(zhǔn)穩(wěn)定的情況下，如果不穩(wěn)定，就可以延長平衡時間。

改善反相色譜柱的操作參數(shù)：

一旦確定了色譜柱規(guī)格、適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嘀盍?、流動相溶劑和添加劑，即可開始進(jìn)行方法優(yōu)化。方法的優(yōu)化取決于具體目標(biāo)。若需開發(fā)質(zhì)量控制方法，可能需要采用較少可變因素的等度分離方法。若目標(biāo)是實現(xiàn)較高的分離度，而節(jié)省分析時間并非首要考慮，則可選擇較長的柱子實現(xiàn)更好的組分分離。若分離速度至關(guān)重要，則應(yīng)選擇較短的柱子和更高的流速。對于含有多種目標(biāo)化合物的復(fù)雜樣品，使用等度分離可能不足以解決問題，應(yīng)考慮開發(fā)和優(yōu)化梯度方法。

根據(jù)慣例，被稱為“流動相A”的是水相溶劑和在反相色譜中相對較弱的溶劑，“流動相B”則是具有更高和更強(qiáng)溶劑成分的。在反相色譜模式下，增加B的百分比通常會導(dǎo)致保留時間縮短。值得注意的是，在實際分析方法開發(fā)之前，許多人采用“試錯”方法來發(fā)展HPLC方法，不斷嘗試不同流動相條件，以找到較佳條件。