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你了解液相色譜的檢測器嗎?

欄目:行業(yè)資訊 發(fā)布時間:2024-03-04
高效液相色譜儀(HPLC)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。檢測器是HPLC的關(guān)鍵組成部分之一,它將色譜柱連續(xù)流出的樣品組分轉(zhuǎn)變成易于測量的電信號,被數(shù)據(jù)系統(tǒng)接收,得到樣品分離的色譜圖。
高效液相色譜儀(HPLC)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。檢測器是HPLC的關(guān)鍵組成部分之一,它將色譜柱連續(xù)流出的樣品組分轉(zhuǎn)變成易于測量的電信號,被數(shù)據(jù)系統(tǒng)接收,得到樣品分離的色譜圖。

常用檢測器有紫外吸收、熒光、示差折光、化學(xué)發(fā)光等。接下來讓我們詳細(xì)介紹一下在液相色譜中六種檢測器的原理及特點。

紫外-可見光檢測器

紫外檢測器是一種應(yīng)用最廣HPLC檢測器,當(dāng)檢測波長范圍包括可見光時,又稱為紫外-可見檢測器。紫外檢測器的工作原理是朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律。
其特點是靈敏度高(檢測下限為10-10g/ml),線性范圍寬,噪聲低,它的最重要特征是對流動相的流速和溫度變化不敏感,適用于梯度洗脫,對強吸收物質(zhì)檢測限可達(dá)1ng,檢測后不破壞樣品,可用于制備,并能與任何檢測器串聯(lián)使用。紫外可見檢測器的工作原理與結(jié)構(gòu)同一般分光光度計相似,實際上就是裝有流動的紫外可見光度計。 
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因此即使是那些光吸收小、消光系數(shù)低的物質(zhì)也可用UV檢測器進行微量分析。但它只能檢測有紫外吸收的物質(zhì),而且流動相有一定限制,即流動相的截止波長應(yīng)小于檢測波長。如果溶劑中含有吸光雜質(zhì),則會提高背景噪音,降低靈敏度。此外,梯度洗脫時或測定波長較短時,基線還會產(chǎn)生漂移。
光電二極管陣列檢測器(PAD)原理與UVD相同,區(qū)別在于PAD可檢測到所有波長的吸收值,是全掃描光譜圖。PAD的優(yōu)點是可以獲得樣品組分的全部光譜信息。
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即,在一次色譜操作中,可同時獲得吸光值、流出時間和各組分的紫外-可見光譜圖在一起的三維譜圖,提供既定量又定性的色譜信號。吸收光譜用于組分的定性,色譜峰面積用于定量。
使用二極管陣列檢測器,可以對色譜峰進行光譜掃描,峰純度鑒定的定性分析,在方法研究中可以快速選擇最佳檢測波長,在多組分混合物分析中可以編輯波長程序。
采用二極管陣列檢測器進行論證,也是目前常采用的一個強有力的手段。它通過對一個色譜峰的數(shù)點進行紫外掃描,然后比較所得到的掃面圖譜的接近程度從而評價被檢測峰的純度。但是,利用二極管陣列檢測器進行峰純度檢查存在兩個缺點:
1、雜質(zhì)濃度低,或與主成分相比吸收太小,達(dá)不到檢測靈敏度,無法檢測出來。
2、當(dāng)雜質(zhì)的發(fā)色團與主成分一致,或者說雜質(zhì)與主組分有相同或幾乎相同的光譜圖且具相近的流出時間,此時雜質(zhì)也無法發(fā)現(xiàn)。

熒光檢測器

熒光檢測器是一種高靈敏的選擇性檢測器,其靈敏度比紫外檢測器高10-1000倍。它適用于檢測能產(chǎn)生熒光的化合物。某些不發(fā)熒光的物質(zhì)可通過化學(xué)衍生化生成熒光衍生物,再進行熒光檢測。它的原理為有機共軛芳環(huán)分子受紫外光激發(fā)后發(fā)出熒光。

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熒光檢測器其靈敏度很高,痕量分析和梯度洗脫樣品的檢測均可采用。其最小檢測濃度可達(dá)0.1ng/ml,適用于痕量分析;一般情況下熒光檢測器的靈敏度比紫外檢測器約高2個數(shù)量級,但其線性范圍不如紫外檢測器寬。

可用于熒光檢測的物質(zhì)有某些代謝物、食品、藥物、氨基酸、多肽、生物堿和甾族化合物等。由于熒光檢測器的高靈敏度和選擇性,它是體內(nèi)藥物分析常用的檢測器之一。 但其基線穩(wěn)定需要平衡的時間較長。

示差折光檢測器

示差折光檢測器的檢測基于被分析物的折光指數(shù)的差異,即測量樣品流路與參比流路在折光指數(shù)上的差別。當(dāng)折光指數(shù)差異最大時靈敏度也達(dá)到最大。它并不測量絕對的折光指數(shù)而是測定折光指數(shù)的差別。其典型的應(yīng)用領(lǐng)域為沒有紫外吸收、熒光的化合物,例如:碳水化合物、聚合物脂肪酸及油脂類等。
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光從一種介質(zhì)進入另一種介質(zhì)時,由于兩種物質(zhì)的折射率不同就會產(chǎn)生折射。只要樣品組分與流動相的折光指數(shù)不同,就可被檢測,二者相差愈大,靈敏度愈高,在一定濃度范圍內(nèi)檢測器的輸出與溶質(zhì)濃度成正比。
示差檢測器為通用檢測器,容易使用。通常來說是比較耐用的檢測器,維護成本低。但其靈敏度低、選擇性差,對流速、溫度及粘度的變化敏感,不能用于梯度洗脫。而且,色譜峰可能是正的,也可能是負(fù)的。

電化學(xué)檢測器

電化學(xué)檢測器包括極譜、庫侖、安培和電導(dǎo)檢測器等。電導(dǎo)檢測器廣泛用于離子色譜儀中,應(yīng)用于能電離成離子物質(zhì)的檢測,其響應(yīng)受溫度影響較大。

安培檢測器應(yīng)用最廣泛,其靈敏度很高,尤其適合于痕量組分的分析,凡具氧化還原活性的物質(zhì)都能進行檢測,如活體透析液中的生物胺,還有酚、羰基化合物、巰基化合物等。本身沒有氧化還原活性的化合物經(jīng)過衍生化后,也能進行檢測。

電化學(xué)檢測器是根據(jù)電化學(xué)原理和物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)進行檢測。在液相色譜中,它可以檢測出所有電活性物質(zhì)。因此,對部分沒有紫外吸收或不能發(fā)出熒光但具有電活性的物質(zhì),可采用電化學(xué)檢測法進行檢測。若在分離柱后采用衍生技 術(shù),還可將它擴展到非電活性物質(zhì)的檢測。

化學(xué)發(fā)光檢測器

化學(xué)發(fā)光檢測器(Chemiluminescence detector, CD)是近年來發(fā)展起來的一種快速、靈敏的新型檢測器,因其設(shè)備簡單、價廉、線性范圍寬等優(yōu)點。其原理是基于某些物質(zhì)在常溫下進行化學(xué)反應(yīng),生成處于激發(fā)態(tài)勢反應(yīng)中間體或反應(yīng)產(chǎn)物,當(dāng)它們從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時,就發(fā)射出光子。

由于物質(zhì)激發(fā)態(tài)的能量是來自化學(xué)反應(yīng),故叫作化學(xué)發(fā)光。當(dāng)分離組分從色譜柱中洗脫出來后,立即與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)發(fā)光試劑混合,引起化學(xué)反應(yīng),導(dǎo)致發(fā)光物質(zhì)產(chǎn)生輻射,其光強度與該物質(zhì)的濃度成正比。 

這種檢測器不需要光源,也不需要復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng),只要有恒流泵,將化學(xué)發(fā)光試劑以一定的流速泵入混合器中,使之與柱流出物迅速而又均勻地混合產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,通過光電倍增管將光信號變成電信號,就可進行檢測。這種檢測器的最小檢出量可達(dá)10-12g。

在化學(xué)史上有許許多多精美絕倫的實驗,美國的“化學(xué)與工程新知”組織在2003年,邀請全球的眾多化學(xué)家和歷史學(xué)家共同投票選出十大最美麗實驗,排名第一的是19世紀(jì)中葉巴斯德在顯微鏡下手工分離手性酒石酸鹽晶體。

蒸發(fā)光散射檢測器

蒸發(fā)光檢測器(ELSD)是基于光線通過微小的粒子會產(chǎn)生光散射現(xiàn)象的原理。樣品經(jīng)色譜柱分離后會被氮氣噴為霧狀液滴,云霧狀溶質(zhì)顆粒通過光路后產(chǎn)生光散射。ELSD要優(yōu)越于RID,靈敏度及檢出限高,對溫度敏感程度低,適用于梯度淋洗。

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檢測器是高效液相色譜儀的重要組成部分,不同的檢測器的原理、使用的范圍和對象不同。所以針對不同的檢測器,我們應(yīng)該注意的重點也不同。只有這樣,才能更好完成日常的分析檢測工作,提高工作效率。


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