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重組蛋白分離純化的基本原則

欄目:行業(yè)資訊 發(fā)布時間:2021-06-01
不管黑貓白貓,抓到老鼠就是好貓,對純化來講亦如此,能拿到純度好的蛋白,符合純化要求就是硬道理。不同蛋白純化工藝不同,即使相同的原料也有不同的純化方案。

  不管黑貓白貓,抓到老鼠就是好貓,對純化來講亦如此,能拿到純度好的蛋白,符合純化要求就是硬道理。不同蛋白純化工藝不同,即使相同的原料也有不同的純化方案。蛋白質(zhì)純化方法的選擇主要是利用不同蛋白質(zhì)之間的相似性與差異,依據(jù)蛋白之間的相似性可以去除非蛋白物質(zhì),在根據(jù)蛋白的差異性將目的蛋白分離出來,所以要取得好的純化結果所可以采用的策略及原則卻是共通的。

分離純化

  1.針對不同的產(chǎn)物表達形式采用不同的策略:

  a)融合型表達重組蛋白,一般胞內(nèi)可溶性的,擬選用親和層析進行純化;

  b)分泌型表達的重組蛋白,通常體積大、濃度低,因此應在純化之前采用沉淀或超濾等方法先進行濃縮處理;

  c)包涵體型表達的重組蛋白,應先離心回收包涵體;

  d)表達在細胞膜和細胞壁之間的間隙中的蛋白質(zhì),應用低濃度的溶菌酶,然后再用滲透壓休克法釋放重組蛋白。

  2.針對不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型:

  a)離子交換法(IEX):等電點處于區(qū)域(PI≤5或PI≥8)的重組蛋白應選IEX進行分離,這樣很容易除去幾乎所有的雜蛋白。

  b)親和層析(AC):重組蛋白特異性的配體、底物、抗體、糖鏈等都是親和層析純化的重要條件,原則是它們與目的蛋白之間的解離常熟應在合適的范圍內(nèi)(10-8—10-4mol/L)

  c)疏水(HIC)和反相層析:根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性差異進行分離的。

  d)凝膠過濾層析(GF):根據(jù)蛋白的分子量進行分離。

  3.每一種方法都有分辨率、處理量、速度和回收率之間的平衡:

  a)分辨率:由選擇的方法和層析介質(zhì)生成窄峰的能力來完成。當雜質(zhì)和目的蛋白性質(zhì)相似是,在純化的zui后階段分辨率是選擇層析方法的重要考量標準。

  b)處理量:指在純化過程中目標蛋白的上樣體積和濃度等。

  c)速度:在初純化中是重要因素,此時雜質(zhì)如蛋白酶必須盡快去除。

  d)回收率:隨著純化的進行漸趨重要,因為純化產(chǎn)物的價值在增加。

  4.多種分離純化技術聯(lián)合運用:

  a)選能除去含量zui多雜質(zhì)的方法;

  b)盡量選擇的分離方法;

  c)將zui費時、成本zui高的分離純化方法安排在zui后階段。

  d)通過組合各種方法使純化步驟之間的樣品處理減至zui少,以避免需要調(diào)節(jié)樣品。*個步驟的產(chǎn)物的洗脫條件應適宜下一個步驟的起始條件。

  e)如果對目的蛋白的性質(zhì)了解甚少的情況下,可采用IEX-HIC-GF的聯(lián)合運用作為標準方案。

  5.重組蛋白分離純化的共同參考階段:

  a)捕獲階段:目的蛋白的澄清、濃縮和穩(wěn)定。選擇對目的蛋白具有zui高選擇性或/和處理量的方法。

  b)中度純化階段:目標是除去大多數(shù)大量雜質(zhì),如其它蛋白、核酸、內(nèi)毒素和病毒等。

  c)精純階段:除去殘余的痕量雜質(zhì)和必須去除的雜質(zhì)。

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