HPLC緩沖液通常用于控制在液相色譜分析中所不希望出現(xiàn)的二次相互作用。此外，緩沖液也被用來工作分析物的電離狀態(tài)，以確保分析物不會(huì)同時(shí)出現(xiàn)一個(gè)以上的電離狀態(tài)。

化合物的pKa值代表此化合物的50%離子化和50%中性時(shí)的pH值。如果在此pH值下分析此化合物，你會(huì)看到分裂峰的出現(xiàn)或者不穩(wěn)定的保留時(shí)間。因此，我們建議所有的分析方法的pH值都應(yīng)該控制在目標(biāo)分析化合物的pKa值正負(fù)兩個(gè)pH單位以上。

1.盡可能提前預(yù)混合你所使用的流動(dòng)相，因?yàn)檫@將防止經(jīng)過泵混合流動(dòng)相時(shí)會(huì)出現(xiàn)的錯(cuò)誤。

2.每一次都需要始終使用相同的配制方法及流程。例如，如果你方法是先加水，那你每次都必須是先加水。如果你是先測(cè)定單獨(dú)的成分然后再混合，那你就必須每次都按這個(gè)流程來做。記得千萬(wàn)不要改變這一個(gè)固定的配制流程，因?yàn)檫@個(gè)配制流程的改變讓分析物的保留時(shí)間可能出現(xiàn)很大的改變。

以下的這個(gè)實(shí)驗(yàn)例子展示了當(dāng)流動(dòng)相

用以下不同的方式來混合時(shí)，

峰保留時(shí)間可能出現(xiàn)的改變

先加水：先用量筒量400mL的水并倒進(jìn)1L的容量瓶中，然后用甲醇稀釋至容量瓶的刻度。

先加甲醇：先用量筒量600mL的甲醇并倒進(jìn)1L的容量瓶中，然后用水稀釋至容量瓶的刻度。

甲醇和水各自先量好：先用量筒量600mL的甲醇并倒進(jìn)流動(dòng)相瓶中，然后用同樣的量筒量400mL的水并倒進(jìn)已經(jīng)裝有甲醇的流動(dòng)相瓶中。

讓液相的泵來混合A瓶中的水和B瓶中的甲醇。

緩沖液的濃度必須非常精確地平衡好，以確保在所有的條件下都能達(dá)到完全溶解。在反相條件下，如果方法條件是包含了高比例有機(jī)相的話（例如跨度很大的梯度），則很有可能需要控制緩沖液的濃度，以確保不會(huì)出現(xiàn)緩沖鹽的析出。

當(dāng)開發(fā)一個(gè)可靠穩(wěn)定的HPLC方法時(shí)，流動(dòng)相的貢獻(xiàn)跟色譜柱固定相的選擇性一樣重要，另外流動(dòng)相的選擇與配制也是一樣重要的。